強力水樣DNA提取試劑盒中文說明書

PowerWater® DNA Isolation kit

強力水樣DNA提取試劑盒

(提取已過濾水樣的濾膜微生物基因組DNA)

 

 

簡介

PowerWater® DNA Isolation Kit可提取各種過濾好的水樣基因組DNA。利用我們的專利抑制因子去除技術®(IRT)，就算水樣中含大量污染物，也能順利地提取出高質量高得率的DNA。該試劑盒可兼容市面上所有類型的水樣濾膜。與我們的UltraClean® Water DNA Isolation Kit不用在于：研磨珠套管改用了創新優化的研磨珠混合、修改的裂解緩沖液配方、IRT技術和減少樣品體積使得可以在一個小型離心管中完成所有操作。最終DNA體積為100μl，可直接用于下游實驗。

 

相關產品	貨號	提取次數
Vortex Adapter for Vortex Genie® 2	13000-V1-15 13000-V1-5	Holds 4 (5 ml or 15 ml) Tubes Holds 6 (5 ml) Tubes
Water Filter Adapter	14800-10-WFA	1
Water Filter (0.45 µm)	14800-10-WF 14800-25-WF 14800-50-WF 14800-100-WF	10 units 25 units 50 units 100 units
Water Filter (0.22  µm)	14880-10-WF 14880-25-WF 14880-50-WF 14880-100-WF	10 units 25 units 50 units 100 units
Vortex Genie® 2 Vortex	13111-V-220 13111-V	1 unit (220V) 1 unit (120V)
PCR Water (Certified DNA-free)	17000-1 17000-5 17000-10 17000-11	1 ml 5 x 1 ml 10 x 1 ml 10 ml bottle
RapidWater™ DNA Isolation Kit	14810-50-NF       14810-100-NF	50 preps (No filters) 100 preps (No filters)
PowerVac™ Manifold	11991	1 manifold
PowerVac™ Mini System	11992	1 unit + 20 adapters
PowerVac™ Mini Spin Filter Adapters	11992-10 11992-20	10 adapters 20 adapters

 

設備要求

15ml離心機（≤4000g）

一次性/可重復使用濾過漏斗

濾膜（使用可重復使用濾過漏斗時）

微型離心機（13000g）

移液器

Vortex-Genie®2 渦旋儀（MO BIO貨號#13111-V-220）

渦旋儀適配器（MO BIO貨號#13000-V1-15或13000-V1-5）

真空抽濾系統

 

試劑盒組分

	貨號：14900-50-NF	貨號：14900-100-NF
組分	量	量
PowerWater® Bead Tubes	50	100
Solution PW1	55ml	110ml
Solution PW2	11ml	22ml
Solution PW3	2×18ml	3×24ml
Solution PW4	2×18ml	3×24ml
Solution PW5	2×18ml	3×24ml
Solution PW6	5.5ml	11ml
Spin Filters	50	100
2 ml Collection Tubes	250	500

△實驗前請先逐一檢查試劑!

 

保存

組分室溫（15-30℃）保存。

 

操作步驟：

PW1溶液使用前55℃預熱5-10min。趁熱使用。使用前檢查PW3，若有沉淀則55℃水浴5-10min，可趁熱使用。

1、使用離心機和一次性或可重復利用漏斗過濾水樣。含0.22μm或0.45μm濾膜的一次性濾過漏斗可從MO BIO單獨訂購。過濾水樣的體積視水樣微生物豐度和渾濁程度而定。（水樣類型參照附文疑難點）。

這一步發生了什么：過濾水樣，微生物截留到濾膜表面及濾孔中。

2、取下過濾裝置漏斗部分。

3、使用兩只滅菌鑷子從邊緣夾起濾膜，濾膜上面朝內卷成圓筒狀。

【注意：不要卷太緊或折疊濾膜。"卷濾膜方法"可在以下網址觀看展示視頻。http://www.heartandhomegoods.com/products/14900.htm】

4、把濾膜放入到5ml PowerWater® Bead Tube中。

這一步發生了什么：稍卷濾膜放入PowerWater® Bead Tube中裝備珠磨研磨。

5、往PowerWater® Bead Tube加入1 ml PW1溶液。

【注意：PW1溶液使用前必須先預熱溶解沉淀并趁熱使用。若樣品中含有難裂解微生物（真菌、海藻），可加入額外水浴步驟。詳見附文疑難點。】

這一步發生了什么：PW1為含有去垢劑的強力裂解試劑，可破壞細胞壁，去除非DNA的有機、無機成分。同時也是IRT技術的組成之一。低溫時會形成白色沉淀。55℃水浴不會影響其成分活性。需要趁熱使用�！�

6、把PowerWater® Bead Tube安裝在MO BIO渦旋儀適配器，貨號：13000-V1-15或13000-V1-5。

7、最大轉速渦旋振蕩5min。

這一步發生了什么：渦旋振蕩的機械作用力在打碎濾膜釋放出截留的細胞的同時輔助裂解細胞。使用渦旋儀適配器可提供相同的力矩和角度最大化研磨效果。避免使用膠帶固定，以免震動過程中松脫影響研磨效果。

8、室溫≤4000g離心1min。離心速度視乎離心機參數配置。（具備15ml離心條件可選步驟，不離心的情況會稍微減少獲得上清的量）。

9、使用1ml槍頭深入到研磨珠底部吸取上清，并轉移到一個干凈的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。

【注意：必須把槍頭深入到研磨珠底部。多次吸取確保取出所有上清。上清中混入研磨珠不影響后續。根據使用濾膜的類型，約可獲得600-650μl上清�！�

這一步發生了什么：從濾膜和研磨珠中獲得上清。

10、13000g離心1min。

這一步發生了什么：這一步去除混入的研磨珠、蛋白和細胞碎片。必須去除所有的非DNA有機、無機成分，否則將影響DNA純度并抑制下游DNA實驗。

11、避開沉淀，轉移上清到一個干凈的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。

12、加入200μl PW2，稍微渦旋混勻，4℃孵育5min。

這一步發生了什么：PW2溶液為IRT技術的又一個重要組成。第二次移除非腐植酸、細胞碎片、蛋白等非DNA的有機、無機成分。必須去除所有的非DNA有機、無機成分，否則將影響DNA純度并抑制下游DNA實驗。

13、13000g離心1min。

14、避開沉淀轉移上清到一個干凈的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。

這一步發生了什么：進一步去除非DNA有機和無機物。為了確保DNA得率和質量，避免吸入任何沉淀物。

15、加入650μl PW3，渦旋混勻。

【注意：PW3溶液若有沉淀，使用前先55℃水浴5-10min，可趁熱使用�！�

這一步發生了什么:PW3為高濃度鹽溶液。DNA在高鹽條件下將選擇性地吸附到離心柱硅膠濾膜上。而濾膜上非DNA有機無機物仍然有可能少量殘留。

16、加載650μl上清到一個Spin Filter中，13000g離心1min。棄去濾液重復上述步驟直到過濾完所有上清。

【注意：通常需要加樣兩次�！�

這一步發生了什么：DNA選擇性地吸附到離心柱硅膠濾膜上，濾液不含DNA成分。

17、把Spin Filter放到一個干凈的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。

這一步發生了什么：PW3為高濃度鹽溶液，Spin Filter轉移到新的Tube管中，等待沖洗步驟，以提高DNA得率和純度。

18、PW4使用前先搖勻。加入650μl PW4，13000g離心1min。

這一步發生了什么：PW4為含酒精沖洗液，用于沖洗離心柱濾膜上的DNA。去除殘留的鹽分等雜質。

19、棄去濾液，加入650μl PW5溶液，13000g離心1min。

這一步發生了什么：PW5能確保完全去除PW4成分，可提高DNA純度和得率。

20、棄去濾液，13000g離心2min，充分甩干沖洗液。

這一步發生了什么：二次離心去除殘留PW5溶液。PW5溶液含酒精，必須充分去除以免影響DNA后續實驗。

21、把Spin Filter放到一個干凈的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。

22、加入100μl PW6到離心柱白色濾膜中心。

這一步發生了什么：PW6溶液（無菌洗脫液）加到濾膜中心濕潤整個濾膜。DNA在高鹽條件選擇性吸附到硅膠濾膜上，PW6溶液（10mM Tris）無鹽條件下選擇性地洗脫下來。

可選：此步也可以用無菌的DNA-Free PCR Grade Water（貨號：17000）洗脫硅膠濾膜上的DNA。PW6溶液不含EDTA。若為減少DNA降解，可用無菌TE溶液代替PW6洗脫DNA。

23、13000g離心1min。

24、棄去離心柱。此時DNA可直接用于下游實驗，無需進一步處理。

建議DNA（-20℃-80℃）保存。PW6溶液不含EDTA。

 

若使用PowerVac™ Manifold抽吸代替離心

每個樣品使用一個Spin Filter離心管。保持Spin Filter安放在2ml Collection Tube中知道需要真空抽吸濾過。記號筆標記標注好Collection Tube頂部及Spin Filter。若Spin Filter在過濾過程中堵塞，仍可以改為常規離心繼續繼續提取DNA。

此操作說明書第四步需要外自備100%乙醇。

1、每一個樣品需要安裝一個鋁質PowerVac™ Mini Spin Filter Adapter（MO BIO貨號：11992-10或11992-20）到manifold的魯爾接口上。輕輕用力安緊Spin Filter。關閉manifold其它所有不用的接口。

【注意：鋁質PowerVac™ Mini Spin Filter Adapters可重復使用�！�

2、加載650μl樣品裂解物（接上文步驟15）到Spin Filter。

3、打開真空泵，打開使用的端口的閥門。打開閥門是扶穩Spin Filter，保持直立。等待裂解物全部通過濾膜，再加650μl裂解物。繼續抽吸濾過。關閉閥門。

【注意：可關閉已抽濾的端口，以提高其它端口壓力，加快抽濾速度�！�

4、加入800μl 100%乙醇到Spin Filter。扶穩Spin Filter，打開閥門抽濾。抽濾完成后關閉閥門。

5、PW4使用前先搖勻。每個Spin Filter加入650μl PW4，打開閥門抽濾。當所有PW4濾完后，繼續抽濾1min，抽干濾膜。關閉所有端口。

6、每個Spin Filter加入650μl PW5溶液，打開魯爾接口閥門，開啟真空泵抽濾。當所有PW5濾完后，繼續抽濾1min。關閉所有端口。

7、關閉真空泵。打開一個未使用的端口釋放manifold的壓力。若20個端口都在使用，斷開真空泵連接。進入下一步操作前確保真空壓力已釋放。必須先關閉真空泵，防止濾液倒流。

8、拿下Spin Filter，放回到原來標記的相應2ml Collection Tube中。13000g離心2min以充分干燥濾膜。

9、把Spin Filter轉移到一個新的2ml Collection Tube（試劑盒提供）中，加入100μl PW6到白色濾膜中心�？蛇x：可適用無菌DNA-Free Water洗脫DNA（貨號：17000-10）。

10、室溫13000g離心1min。

11、棄去Spin Filter。此時濾液中的DNA可直接用于下游實驗，無需進一步處理。

 

疑點難點

水樣類型

A. 清亮水樣：水樣可清亮，也可非常渾濁。較干凈的水可大量過濾不堵塞濾膜�？娠嬘盟�根據水的質量和顆粒數量也過濾100ml 到10L。也有報道過濾更大體積的。

B. 渾濁水樣：渾濁水樣有大量懸浮顆�；蛘叱恋砦�，容易堵塞小孔徑（0.22μm）濾膜。這類水樣建議用0.45μm孔徑濾膜。MO BIO單獨有提供含0.22μm或0.45μm濾膜一次性漏斗（訂貨信息見第一頁）。也可以把水樣置于容器中澄清。若不具備澄清條件或不想對水樣澄清，可適用孔徑一大一小層疊過濾水樣。下層放一小孔徑濾膜，上層放一1μm孔徑濾膜，大濾膜截留大塊碎片，小濾膜截留微生物細胞�？捎秒p蒸水或磷酸鹽緩沖液沖洗上層大孔徑濾膜，以增加下沉小孔徑濾膜截留的微生物數量。雖然不能100%有效，但也可以增加微生物DNA的得率。

水樣濾膜選擇

MO BIO提供的含濾膜一次性漏斗可供大多數水樣研究和檢測使用。0.22μm孔徑的濾膜含聚苯醚砜（Pall Supor®），而0.45μm孔徑濾膜為醋酸纖維素制成。有些類型濾膜含有或容易吸附PCR抑制因子。為了減少此情況的發生，使用前先做評估。

忘記預熱PW1

若忘記預熱PW1，而其它操作都正常。你仍能獲得DNA，不過得率可能比較低。

 

可選裂解方法

加熱可輔助裂解某些類型生物體（真菌、藻類）以提高得率。步驟5后，對PowerWater® Bead Tube 65℃水浴10min，步驟6接著繼續。

 

DNA期待得率

根據水樣類型、采樣地點，甚至季節，DNA得率都可能差異很大。下表給出了得率參考值�；�于樣品的多樣性，下列數值只供參考。

 

A260/230數值偏低

A260/230讀數只反映DNA純度。低微生物豐度的樣品，DNA得率（20ng/μl）也低，其比率可能低于1.5。該比率并不能反映DNA樣品的可擴增性或DNA完整性。酒精濃縮法把DNA濃縮成更高濃度有助于提高A260/230比值。

 

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更多產品疑問，請參閱 http://www.heartandhomegoods.com/pages/FAQ.htm "水樣"部分。